第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量测定不同样品中基因表达量的相对值

在进行基因表达量的相对测定时，内参基因的选择至关重要。选择合适的内参基因可直接影响结果的有效性。具体原则如下：

• 始终选择表达丰沛且均一的基因作为内参基因；
• 避免盲目选择使用频率较高的内参基因；
• 常用的内参基因包括GAPDH、Actin和Tublin。

经过内参基因的引入后，结果即可以进行进一步计算。

二、绝对定量

绝对定量是指通过标准品来测定样品中基因表达量的绝对值（拷贝数）。标准品包括：

• A/克隆质粒
• B/PCR产物
• C/cDNA（注意扩增效率的测定等用途，但不适用于绝对定量）

拷贝数计算依据平均分子量（MW）进行。例如：

• dsDNA：拷贝数 = (碱基数) x (660道尔顿/碱基)
• ssDNA：拷贝数 = (碱基数) x (330道尔顿/碱基)
• ssRNA：拷贝数 = (碱基数) x (340道尔顿/碱基)

拷贝数计算公式为：

(602 x 10²³ 拷贝数/摩尔) x (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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